张琼 梁宗文 张安琪 卢晓声 朱望爱 胡越
[摘要] 意图 评论紫铆因对化疗所诱导大鼠卵巢功用危害的改进效果及其或许的效果机制。 办法 挑选雌性Wistar大鼠随机分为对照组、化疗组、联合医治组（环磷酰胺+紫铆因）和紫铆因组，每5天测重；苏木精-伊红染色调查卵泡发育和各级卵泡计数；Elisa法检测雌激素、孕激素水平；Western blot 检测Sirt1和Cleaved Caspase 3 蛋白表达水平。 成果 化疗组大鼠体重、卵巢质量显着小于对照组，联合医治组则显着高于化疗组。化疗组大鼠动情周期紊乱，联合医治组阴道细胞涂片表现为规则的动情周期。化疗组卵巢结构损坏，始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡均少于其他三组。联合医治组血清E2水平显着高于化療组，FSH水平显着低于化疗组。Western blot成果显现化疗组Sirt1蛋白水平低于对照组，Cleaved Caspase 3蛋白水平高于对照组，相反，联合医治组的Sirt1蛋白水平高于化疗组，Cleaved Caspase 3蛋白水平低于化疗组。 定论 紫铆因能够改进化疗对大鼠卵巢功用的危害，其效果机制或许与上调Sirt1按捺细胞凋亡相关。
[要害词] 紫铆因；化疗；卵巢；Sirt1；凋亡
[中图分类号] R711.75 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）34-0035-05
Study on the effect of butein on the improvement of impaired ovarian function induced by chemotherapy
ZHANG Qiong LIANG Zongwen ZHANG Anqi LU Xiaosheng ZHU Wangai HU Yue
Department of Gynecology and Obstetrics， the Second Affiliated Hospital and Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China
[Abstract] Objective To investigate the effect of butein on the improvement of impaired ovarian function induced by chemotherapy in rats and its possible mechanism. Methods Female Wistar rats were randomly divided into control group， chemotherapy group， combined treatment group （cyclophosphamide+butein） and butein group. They were weighed every 5 days； the development of follicles and the count of follicles at all levels were observed by hematoxylin-eosin staining method. The levels of estrogen and progesterone were detected by Elisa method. Western blot was used to detect the expression level of Sirt1 and Cleaved Caspase 3. Results Rats' weight and ovary weight in the chemotherapy group were significantly lower than that in the control group， and the combined treatment group was significantly higher than that in the chemotherapy group； in the chemotherapy group， the estrous cycle of rats was disordered， and the vaginal smear in the combined treatment group showed regular estrous cycle； in the chemotherapy group， the structure of ovary was destroyed， and primordial follicles， primary follicles， secondary follicles and antral follicles were less than those in the other three groups； the level of serum estradiol was significantly higher in the combined treatment group than that in the chemotherapy group， and the level of FSH was significantly lower than that in the chemotherapy group； Western blot analysis showed that the level of Sirt1 protein in the chemotherapy group was lower than that in the control group， and Cleaved Caspase 3 protein level was higher than that in the control group. In contrast， the Sirt1 protein level in the combined treatment group was higher than that in the chemotherapy group， while the Cleaved Caspase 3 protein level was lower than that in the control group. Conclusion Butein can improve the impaired ovarian function induced by chemotherapy； the mechanism may be related to the up-regulation of Sirt1 on the inhibition of cell apoptosis.
[Key words] Butein； Chemotherapy； Ovary； Sirt1； Apoptosis
在女人生殖系统中，卵巢对化疗药物最灵敏[1]，化疗药物在进步肿瘤和免疫性疾病治愈率的一起，会引起卵巢功用障碍、卵巢早衰乃至导致不孕不育，严重影响年青妇女的日子质量和自信心[2]。因而，如安在运用化疗药物的一起维护女人的卵巢功用有巨大的医学需求。细胞凋亡被以为是化疗药物引起卵巢的结构及功用损坏然后导致卵泡丢掉的机制之一[3]。据报导，Sirtuin在保持卵巢功用中起重要效果[4]。其间Sirtuin宗族中的Sirt1，被称为是寿数延伸的要害因子，是一种去乙酰化酶，能够将FOXO（forkhead box class O）去乙酰化然后按捺细胞凋亡[5]，而紫铆因是Sirt1的激活剂[6]，由此估测紫铆因是否能经过上调Sirt1而按捺卵巢颗粒细胞的凋亡，然后对化疗危害卵巢功用起到维护效果。
现在国内外均未见紫铆因与化疗危害卵巢功用的相关报导，本文旨在评论紫铆因预防性使用对化疗后卵巢安排结构、卵巢内排泄功用、各级卵泡数量所起的一系列效果及机制，为临床肿瘤医治和免疫性疾病中使用大剂量的化疗药物后卵巢功用维护的药物开发供给有实用价值的科学依据。
1 材料与办法
1.1 首要试剂
紫铆因（TCI公司，日本）、环磷酰胺（恒瑞医药股份有限公司，我国；国药准字H32020857，0.2 g）、兔抗Sirt1抗体（Cell Signaling公司，美国）、兔抗Cleaved-Caspase 3抗体（Cell Signaling公司，美国）、羊抗兔二抗（ICLlab公司，美国）、BCA试剂盒（Thermo公司，美国）、大鼠FSH、E2 Elisa盒（南京建成生物工程研讨所，我国）。
1.2 试验动物
健康成年雌性清洁级Wistar大鼠[北京维通利华试验动物中心供给，SCXK（京）2011-0011]60只，体重250～280 g，规范条件（22℃～25℃，12 h照明）下养殖，自在取水。
1.3 试验办法
1.3.1 分组 取2月龄雌性Wistar大鼠60只，经阴道涂片承认有正常性周期后开端试验。随机分为4组，对照组：不加任何处理；化疗组：建模后不做其他处理；联合医治组：建模一起喂服紫铆因5 mg/kg 45 d；紫铆因组：不建模同期喂服紫铆因45 d。
1.3.2 建模 在体外树立化疗性卵巢早衰的大鼠模型，选用环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）腹腔打针建模，负荷剂量为50 mg/kg，之后按8 mg/kg的剂量接连腹腔打针14 d[7]。
1.3.3 调查目标 调查大鼠体重、动情周期及卵巢大体状况，在建模前及建模起每天阴道涂片调查大鼠动情周期，每5天监测大鼠体重，并于建模后45 d处死大鼠，取出双侧卵巢，调查大体外观改动及称重。
1.3.4 检测大鼠卵巢的病理改动 将试验所得大鼠一侧卵巢HE染色切片，调查安排形态学改动和卵泡计数。计算办法：计数每张卵巢安排切片上不同阶段的卵泡个数。卵泡的安排学分类[8]：始基卵泡：单个卵母细胞被扁平的前颗粒细胞部分或彻底环绕；初级卵泡：单个卵母细胞被单层立方形的颗粒细胞围住，外周绕以一层扁平卵泡膜细胞；次级卵泡：单个卵母细胞被一层以上颗粒细胞包绕，未呈现卵泡腔；窦状卵泡：存在卵泡腔并可见卵丘颗粒细胞。
1.3.5 血清雌二醇、卵泡刺激素浓度检测 在建模前及建模完成后第1、15、30、45天剪尾取血经过Elisa法检测雌二醇（estradiol，E2）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）水平的改动。
1.3.6 Western blot剖析 试验所得大鼠另一侧卵巢在-80℃冰箱保存，用于Western blot剖析。惯例办法提取卵巢安排总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转移至硝酸纤维（NC） 膜上，用质量分数为5%的BSA/脱脂牛奶关闭NC 膜1 h，参加一抗[Sirt1、Cleaved Caspase 3或β-actin（抗体）∶V（TBS）=1∶1000稀释于TBS中] 4℃过夜；洗膜后参加辣根过氧化物酶符号的抗兔IgG 二抗（1∶2000稀释），室温下缓慢振动2 h；最后用化學发光试剂盒显色、曝光，用图画剖析软件对蛋白条带作灰度扫描剖析，β-actin 作为内参。
1.4统计学处理
选用SPSS16.0统计剖析软件，计量材料以均数±规范差标明，多组间数据比较选用单因素方差剖析，组间比较选用Tukey查验，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 四组大鼠体重和动情周期改动比较
为评价化疗及紫铆因对大鼠体重的影响，每5天丈量大鼠体重1次并记载。试验前各组大鼠体重无统计学差异。试验进程中对照组均匀体重逐步缓慢升高，由建模前的（277.0±2.6）g添加到第45天的（309.0±1.0）g；化疗组在建模阶段体重呈进行性下降，由建模前的（276.3±3.2）g降至第15天的（260.0±3.0）g，之后逐步缓慢升高，第45天体重为（283.7±3.5）g，较对照组显着下降（P<0.05）；联合医治组第45天体重为（300.5±1.2）g，显着高于化疗组（P<0.05）（表1）。
正常大鼠动情周期4～5 d，其间动情前期17～21 h，动情期9～15 h，动情后期10～14 h和动情间期60～70 h[9]。对照组和联合医治组大鼠在整个调查期监测阴道掉落细胞涂片可见正常的动情周期，依然存在动情前期、动情期、动情后期及动情间期4个显着时期；化疗组大鼠可见动情周期紊乱，动情期缩短乃至消失，为持续性的动情间期。
2.2四组大鼠卵泡数量、卵巢质量及卵巢安排形态学改动比较
各组大鼠在喂食45 d后，取大鼠双侧卵巢并称重。成果显现，化疗组大鼠卵巢均匀质量显着小于对照组（P<0.05），而联合医治组卵巢质量较化疗组显着添加（P<0.05）（表2），紫铆因组与对照组比较无显着差异。
在第45天处死大鼠的卵巢中，对照组可见各级正常卵泡，且始基卵泡、初级卵泡多见，颗粒细胞多且摆放规整；化疗组卵巢结构损坏，始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡均少于其他三组，差异有统计学含义（P<0.05），可见很多闭锁卵泡，颗粒细胞黄素化、摆放紊乱；联合医治组及紫铆因组可见各级正常卵泡，闭锁卵泡少（表2、图1）。
2.3 四组大鼠血清雌二醇（E2）和卵泡刺激素（FSH）浓度比较
本研讨测定的大鼠动情间期的血清E2和FSH水平相当于根底的E2和FSH水平。给药前，各组血清E2和FSH水平无统计学差异（P>0.05）。
给药期间，对照组和紫铆因组E2水平呈正常动摇，化疗组大鼠的血清E2于第15地利显着下降，尔后再动摇，第45天显着低于对照组（P<0.05）；联合医治组大鼠的血清E2于第15天低于对照组，但显着高于化疗组（P<0.05），尔后逐步回归，第45天E2值与对照组无差异（表3）。
给药期间，对照组和紫铆因组FSH水平呈正常动摇，化疗组大鼠的血清FSH于第15地利达最高峰，显着高于对照组（P<0.05），尔后在高水平动摇，第45天仍显着高于对照组（P<0.05）；联合医治组大鼠的血清FSH显着低于化疗组（P<0.05）（表4）。
2.4 Sirt1和Cleaved Caspase 3 蛋白在大鼠卵巢安排中的表达水平
Western blot检测成果显现（图2、表5），各试验组Sirt1蛋白和Cleaved Caspase 3蛋白表达水平存在显着差异（F=345.0，P<0.05；F=98.7，P<0.05）。化疗组大鼠卵巢Sirt1蛋白表达水平显着低于对照组（P<0.05），联合医治组及紫铆因组Sirt1蛋白表达水平显着高于对照组及化疗组（P<0.05）。化疗组大鼠卵巢Cleaved Caspase 3蛋白表达水平显着高于对照组和联合医治组（P<0.05）。
3评论
化疗药物的使用使得各种肿瘤和免疫性疾病治愈率得到进步的一起，所带来的并发症越来越多，因而遭到临床医生的注重。卵巢作为化疗药物毒性效果的一个特别靶器官，露出于有必要的化疗可使卵巢功用遭到不同程度危害，呈现月经失调、轻重不等的卵巢功用衰竭，乃至导致不孕不育，严重影响年青妇女的日子质量和自信心[10]。研讨显现，64%的成年女人患者阅历肿瘤医治后随同至少一项卵巢功用衰竭的症状[11]。因而，探寻化疗对卵巢功用危害的对策成为近年的研讨热门，如促性腺激素开释激素类似物（Gonadotropin-releasing-hormone analogues，GnRHa）的使用[12，13]，但费用昂扬；还有学者提出安排冷冻保存-自体移植（Cryopreservation-autotransplantation）方面[14]，安排冷冻保存-自体移植存在技术性、安全性，乃至道德性问题需求进一步处理，适用领域较为限制，现在没有临床推广使用，故寻觅一种安全有用的办法使化疗药物的卵巢危害降到最低成为燃眉之急。
紫铆因首要从腰果树、降香黄檀和漆树中提取，是一种查尔酮类物，对机体抗氧化、抗炎症及抗重生血管活性等多个方面起重要调节效果[15，16]。但紫铆因对卵巢功用的效果，特别对化疗危害卵巢功用的影响并未有报导。有学者以为化疗对卵巢功用的危害首要反映在卵巢储藏功用的下降，而反映卵巢储藏功用的直接目标是卵泡的数量，直接目标有根底FSH和E2。本研讨以客观目标证明紫铆因能有用改进化疗所造成的的卵巢功用下降并说明其效果机制。
3.1 紫铆因干涉化疗对卵巢分量及卵泡数量的影响
有研讨对化疗患者的卵巢安排取活检后发现卵巢萎缩、体积变小，卵巢的各级卵泡数均削减，特别是初级和次级成长卵泡的削减最显着，乃至呈现无卵泡卵巢[17]。本试验成果发现与对照组比较，化疗组的卵巢分量、始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡均削减，可见很多闭锁卵泡，颗粒细胞黄素化、摆放紊乱，标明化疗可导致卵巢结构破壞，引起卵巢早衰。相反，化疗联合紫铆因联合医治组可见各级正常卵泡，且始基卵泡、初级卵泡多见，颗粒细胞多且摆放规整，估测紫铆因可改进化疗对卵巢大体和结构的危害。
3.2 紫铆因干涉化疗对卵巢内排泄功用危害的效果
化疗药物致女人性腺功用损坏的常见结局是卵巢早衰，性激素水平的成果常见有FSH显着升高，E2水平低下[18]。本试验成果显现化疗组血清E2显着低于对照组和联合医治组，血清FSH显着高于对照组和联合医治组，提示化疗对卵巢内排泄功用有必定的危害效果，而紫铆因干涉能削减化疗所导致的卵巢内排泄功用的危害，究其原因或许是化疗药物损坏卵泡正常结构、削减卵泡数量，使性激素排泄削减，继而反应性引起促性腺激素开释激素的排泄添加，而紫铆因干涉能保存卵泡正常结构，改进受损的卵巢功用，康复正常性激素排泄。
3.3 紫铆因改进化疗危害卵巢功用的效果机制
卵巢颗粒细胞包绕着卵母细胞，在卵泡发育进程中起着支撑、养分卵母细胞的功用，然后保证卵泡发育、排卵、卵子受精和胚胎发育。化疗导致卵巢功用危害的主导途径或许是启动了细胞凋亡[19]。研讨证明前期卵泡的卵细胞发作凋亡，然后导致卵泡闭锁和丢掉；晚期成长卵泡因为颗粒细胞凋亡而发作卵泡闭锁。受化疗药物影响，卵泡内的一些特定的信号被激活而促进细胞发作凋亡，按捺此进程就有或许按捺凋亡，然后维护卵巢功用，这为维护女人肿瘤患者化疗后卵巢功用和生殖才能供给了新的途径。
本研讨调查成年雌性大鼠在化疗和紫铆因干涉下卵巢Sirt1 及促凋亡蛋白Cleaved Caspase 3的表达水平。成果显现，化疗组Sirt1蛋白的表达相对于对照组显着下降，而联合紫铆因医治组Sirt1蛋白水平比对照组显着增高。既往研讨提示，紫铆因是Sirt1的激活剂[6]，而Sirt1是寿数延伸效应的要害因子。对Sirt1转基因小鼠研讨发现其性成熟推迟而Sirt1基因缺点小鼠不能生育[20]。由此可见Sirt1对卵巢功用有着重要效果。与对照组比较，化疗组的卵巢Cleaved Caspase 3蛋白表达显着增高，标明化疗对卵巢功用的危害；而化疗联合紫铆因医治能显着下调Cleaved Caspase 3 蛋白表达，起到调控卵巢颗粒细胞凋亡的效果。本研讨成果显现，Sirt1能按捺卵巢颗粒细胞的凋亡。因而估测，紫铆因或许经过激活Sirt1，按捺细胞凋亡，然后完成对化疗危害卵巢功用的改进。
综上所述，紫铆因能够改进化疗对大鼠卵巢功用的危害，其效果机制或许与激活Sirt1、添加Sirt1表达、按捺细胞凋亡、保持卵泡池储藏相关。本研讨为临床肿瘤医治和免疫性疾病中使用大剂量化疗药物后卵巢功用维护的药物开发供给新的思路。
[参考文献]
[1] Bedoschi G，Navarro PA，Oktay K. Chemotherapy-induced damage to ovary：Mechanisms and clinical impact[J]. Future Oncology，2016，12（19）：2333-2344.
[2] Champagne C，Taylor M，Farrant P. Permanent chemotherapy-induced nonscarring alopecia and premature ovarian failure[J]. Clinical and Experimental Dermatology，2015，40（5）：589-590.
[3] Morgan S，Anderson RA，Gourley C，et al. How do chemo- therapeutic agents damage the ovary？[J]. Ham Reprod Update，2012，18（5）：525-535.
[4] Zhang X，Li L，Xu J，et al. Rapamycin preserves the follicle pool reserve and prolongs the ovarian lifespan of female rats via modulating mTOR activation and sirtuin expression[J]. Gene，2013，523（1）：82-87.
[5] Michan S，Sinclair D. Sirtuins in mammals：Insights into their biological function[J]. Biochem J，2007，404（1）：1-13.
[6] Yang J，Kong X，Martins-Santos ME，et al. Activation of SIRT1 by resveratrol represses transcription of the gene for the cytosolic form of phosphoenolpyruvate carboxykinase（GTP） by deacetylating hepatic nuclear factor 4alpha[J].Journal of Biological Chemistry，2009，284（40）：27042-27053.
[7] Fu X，He Y，Xie C，et al. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation improves ovarian function and structure in rats with chemotherapy-induced ovarian damage[J].Cytotherapy，2008，10（4）：353-363.
[8] 謝幸，苟文丽. 妇产科学[M]. 第8版，北京：公民卫生出版社，2014：1.
[9] 陈亮. 一种新的评价大鼠孕龄的办法[D]. 南京大学，2012.
[10] Long JP，Wan F，Zhang F，et al. DTC chemotherapy regimen is associated with higher incidence of premature ovarian failure in women of reproductive age with breast cancer[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2016，20（6）：1087-1092.
[11] Bines J，Oleske DM，Cobleigh MA. Ovarian function in premenopausal women treated with adjuvant chemotherapy for breast cancer[J]. Journal of Clinical Oncology，1996， 14（5）：1718-1729.
[12] Blumenfeld Z，Zur H，Dann EJ. Gonadotropin-releasing hormone agonist cotreatment during chemotherapy may increase pregnancy rate in survivors[J]. Oncologist，2015， 20（11）：1283-1289.
[13] Blumenfeld Z. Endocrine prevention of chemotherapy-induced ovarian failure[J]. Future Oncology，2016，12（14）：1671-1674.
[14] Schmidt KT，Rosendahl M，Ernst E，et al. Autotransplantation of cryopreserved ovarian tissue in 12 women with chemotherapy-induced premature ovarian failure：The Danish experience[J]. Fertility & Sterility，2011，95（2）：695-701.
[15] Zhang L， Yang X， Li XU，et al. Butein sensitizes HeLa cells to cisplatin through the AKT and ERK/p38 MAPK pathways by targeting FoxO3a[J]. International Journal of Molecular Medicine，2015，36（4）：957-966.
[16] Seo WY，Youn GS，Choi SY，et al. Butein，a tetrahydroxychalcone，suppresses pro-inflammatory responses in HaCaT keratinocytes[J]. Bmb Reports，2015，48（9）：495-500.
[17] 徐安定，鄧晓惠. 放化疗致卵巢危害的机制及其安排学改动[J]. 世界生殖健康/计划生育杂志，2006，25（6）：333-336.
[18] Qin JJ，Rui-Man LI，Qian WU. Effects of different prescriptions for reinforcing kidney on chemotherapy-induced premature ovarian failure[J]. Chinese Journal of Pathophysiology， 2012，28（10）：1847-1850.
[19] Falcone T，Moore HC. GnRH agonist for gonadal protection during chemotherapy[J]. Human Reproduction，2015， 30（12）：2711-2712.
[20] Laura Bordone，Cohen D，Ashley Robinson，et al. SIRT1 transgenic mice show phenotypes resembling calorie restriction[J]. Aging Cell，2007，6（6）：759-767.
（收稿日期：2016-09-16）
