徐涛 易阳艳
[摘要] 意图 选用LDH法测定纤维蛋白胶对人脂肪干细胞的细胞毒性。 办法 取成人吸脂术后的抛弃脂肪安排并从中得到人脂肪干细胞，别离制成50%浸提液组、100%浸提液组、阴性对照组、阳性对照组，并选用LDH检测试剂盒测定各组纤维蛋白培育液中LDH的含量。 成果 原代ASCs生長缓慢，传代后成长加快，且ASCs呈成纤维样细胞形状；24 h和72 h两个时刻点中50%纤维蛋白胶浸提液组、100%纤维蛋白胶浸提液组别离与阴性对照组比较，差异无统计学含义（P>0.05）。 定论 纤维蛋白胶对ASCs无显着细胞毒性，可为以纤维蛋白胶为支架资料的脂肪安排工程研讨供给参阅。
[要害词] LDH法；纤维蛋白胶；脂肪干细胞；细胞毒性
[中图分类号] R622 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）13-0038-03
[Abstract] Objective To determine the cytotoxicity of fibrin glue to human adipose stem cells by LDH method. Methods The abandoned adipose tissue of human liposuction was taken and the human adipose stem cells were obtained and made into the 50% leaching solution group， 100% leaching solution group， negative control group and positive control group.And the LDH test kit was used to detect the content of LDH in each fibrin culture medium. Results The growth of primary ASCs was slow. The growth of ASCs was accelerated after passage， and ASCs appeared fibroblast-like morphology. There was no significant difference between 50% fibrin glue extract group ，100% fibrin glue extract group and the negative control group at 24 and 72 hours（P>0.05）. Conclusion Fibrin glue has no obvious cytotoxicity on ASCs， and it can give a reference to the study of adipose tissue engineering with fibrin glue as scaffold.
[Key words] LDH method； Fibrin glue； Adipose stem cells； Cytotoxicity
软安排残缺是整形外科临床工作中常常遇到的问题，中老年人面部软安排容量削减的纠正也有着广泛需求。现在临床上常用的作为软安排填充的资料可大致分为两类：一类是暂时性填充资料，它们一般是人工合成的机体安排中的正常成分，如透明质酸或胶原蛋白，其因具有生物相容性好、可被降解吸收的长处而运用广泛，但也存在填充效果保持时刻短的缺陷；另一类是永久性填充资料，它们一般是人工合成的慵懒资料组成，如硅胶，其作为软安排填充具有异物植入、效果不自然的缺陷[1，2]。自体脂肪颗粒移植近年来开展较快，但移植后的脂肪颗粒的存活尚不抱负，导致移植存活率较低，需求屡次手术才干到达需求的填充效果[3，4]。近年来，跟着脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ASCs）的发现，依据安排再生原理的脂肪安排工程得到了极大开展，以脂肪干细胞为种子细胞的脂肪安排工程研讨成为热门[5]。本研讨拟选用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）法研讨纤维蛋白胶关于ASCs的细胞毒性，以期为以纤维蛋白胶为支架资料的脂肪安排工程的深化研讨供给参阅。
1 资料与办法
1.1 首要试剂与仪器
FBS、低糖DMEM培育基、胰蛋白酶（Gibco）；Ⅰ型胶原酶、纤维蛋白原、凝血酶（Sigma）；乳酸脱氢酶检测试剂盒（南京凯基）。倒置相差显微镜，CO2培育箱，多功能酶标仪（Thermo）。
1.2 人脂肪干细胞的获取
人脂肪干细胞从吸脂术后抛弃的脂肪安排中提取，术前已征得患者征得赞同，研讨经由医院道德委员会同意。
取成人吸脂术后的抛弃脂肪安排5 mL，参加等体积的浓度为1.0 mg/mL的Ⅰ型胶原酶溶液，摇晃混匀后置于水浴箱37℃消化30 min。消化后以1000 r/min的转速离心5 min，去除上层油脂及液体成分。用含有10% FBS的低糖DMEM培育基重悬细胞，并调整细胞浓度为（5～10）×105个/L，接种至25 cm培育瓶中惯例培育。48 h后初次换液，交融至80%左右时用胰蛋白酶消化传代。传至第3代用于后续的试验。
1.3 纤维蛋白胶浸提液的制备
参阅ISO 10993医疗器械生物学点评规范，提取纤维蛋白胶浸提液。首要用双联打针器别离汲取等体积的50 mg/mL纤维蛋白原溶液和500 IU/mL凝血酶溶液，均匀打针于6孔板中，使所构成的纤维蛋白胶铺满6孔板底部。待成胶后依照资料表面积/液体体积=3 cm2/mL的规范参加DMEM培育基，37℃孵箱中浸提72 h后取得100%纤维蛋白胶浸提液，将该浸提液参加等体积DMEM培育基稀释取得50%纤维蛋白胶浸提液。将取得的纤维蛋白胶浸提液参加10%的胎牛血清，于4℃保存待后续试验运用。
1.4 LDH检测试剂盒测定各组培育液中LDH的含量
细胞毒性检测分为以下四组：阴性对照组、50%纤维蛋白胶浸提液组、100%纤维蛋白胶浸提液组、阳性对照组（最大酶活性开释对照）。将传至第3代的ASCs胰酶消化后调整细胞浓度为1×107/L的细胞悬液，每孔100 μL接種至96孔板中，培育24 h细胞贴壁后吸弃培育液，按上述分组别离参加以下四种培育液：DMEM培育基（阴性对照组）、50%纤维蛋白胶浸提液、100%纤维蛋白胶浸提液、含6.4%的苯酚的DMEM培育基（阳性对照组）。每组设置复孔5个，共种板2板。然后置于37℃孵箱中培育。别离在孵育24 h、72 h后取出一块96孔板，汲取各孔培育液，1000 r/min离心5 min去除沉积。运用LDH检测试剂盒依照说明书检测各组培育液中LDH的含量。
1.5 统计学办法
数据选用SPSS17.0统计学软件进行剖析处理。计量资料以均数±规范差表明，组间比较选用单要素方差剖析，组间两两比较选用SNK-q查验。P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 人脂肪干细胞形状学调查
从人脂肪抽吸物中经酶消化法提取原代ASCs，原代ASCs成长缓慢，约7 d长满培育瓶。传代后成长加快，约3 d左右即可传代。传代后的ASCs形状典型，呈成纤维样细胞形状，有粗大的足突，核仁显着，细胞成长较密时呈显着的漩涡状散布（封三图1）。
2.2 各组培育液中LDH的含量检测成果
各组细胞培育24 h和72 h后的上清液中LDH浓度测定成果显现，24 h和72 h两个时刻点中50%纤维蛋白胶浸提液组、100%纤维蛋白胶浸提液组别离与阴性对照组比较，均无显着差异（P>0.05），提示纤维蛋白胶浸提液并不添加ASCs的LDH开释。见表1。
3 评论
在脂肪安排工程构建中，支架资料是要害的组成部分，安排工程中的支架资料需求满意多个条件，如具有杰出的生物相容性、在特定的时刻内能够被降解等。纤维蛋白胶（fibrin gel）是模仿凝血反响，纤维蛋白原在凝血酶的效果下构成的具有必定物理强度的胶状物[6]。已经有报导纤维蛋白胶作为支架资料用于多种安排工程的研讨中，可是，纤维蛋白胶作为支架资料复合ASCs用于构建安排工程脂肪尚缺少满足研讨[7]。本研讨中，咱们经过酶消化法从脂肪安排中获取了人的ASCs。经过检测纤维蛋白胶浸提液培育人ASCs后LDH的开释量，点评纤维蛋白胶关于体外培育的ASCs的细胞毒性，成果显现纤维蛋白胶关于ASCs无显着的细胞毒性，为纤维蛋白胶作为支架资料复合ASCs构建安排工程脂肪的深化研讨供给参阅。
传统的安排工程构建战略是将种子细胞与支架资料复合，经过必定诱导处理之后植入体内，因此，种子细胞和支架资料是其两大要害要素。Zuk PK等[8]在2001年首要报导了在脂肪抽吸物中培育出了具有间充质干细胞特性的细胞种群，命名为ASCs。因为脂肪获取简单以及获取量大，因此从脂肪中获取ASCs具有很好的运用远景。ASCs的发现促进了脂肪安排工程的开展，探究使用ASCs构建出安排工程化的脂肪安排是近年来的热门研讨范畴[9，10]。
在安排工程中，需求将种子细胞栽培于三维支架上，因此，支架资料是影响安排构建的另一个重要要素。依据支架资料的塑形特色，大致可分为预塑形多孔支架资料和可打针性凝胶资料[11]。一般来说，关于脂肪安排工程，可打针型凝胶支架构建的可打针型软安排填充物具有显着优势：手术伤口小；填充均匀，特别是修正不规则残缺效果更好[12]。
纤维蛋白胶是将纤维蛋白原和凝血酶混合，模仿凝血反响的最终通路，纤维蛋白聚合构成水凝胶，经过双联打针器能够很简单完成打针填充。因为纤维蛋白胶具有杰出的可降解功能，因此具有作为支架资料用于安排工程中的潜力。已经有报导将纤维蛋白胶用于多个范畴的研讨，如用于平滑肌、骨、软骨安排工程研讨中[13，14]。关于任何需求植入机体的资料而言，其生物相容性是必需要点评的要素。植入资料的生物相容性点评依据国际规范首要分为三个过程：第一步是体外细胞毒性检测，调查其关于体外培育的细胞的成长增殖的影响，以此来点评其细胞毒性；第二步是动物体内试验，首要用于点评资料关于机体部分和全身的毒性效果；第三步为临床试验。因此，在研讨一个资料的生物相容性时，首要要点评的就是其细胞毒性效果。LDH是用于点评细胞毒性的常用目标之一，其在细胞膜遭到损害或许决裂时被开释到细胞外，因此，LDH开释程度就反映了细胞受损程度，其开释越多，细胞损害越严峻[15]。
在本试验中咱们别离制备了两种不同浓度的纤维蛋白胶浸提液，即100%浸提液和50%浸提液，并且在培育的第1、3天进行检测，成果显现100%浸提液组和50%浸提液组与阴性对照组比较差异均无统计学含义（P>0.05）。该成果提示纤维蛋白胶浸提液不影响ASCs的LDH的开释，也就提示纤维蛋白胶关于ASCs无显着细胞毒性。
纤维蛋白胶作为支架资料用于脂肪安排工程尚无满足的研讨报导，本研讨仅经过LDH法点评了纤维蛋白胶关于体外培育的ASCs的细胞毒性，还需求更多深化而全面的研讨来断定纤维蛋白胶作为安排工程支架资料的可行性和安全性。
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（收稿日期：2017-03-14）
